抑郁症属于情感性心境障碍，以显著而持久的情绪低落、快感缺失为核心症状，具有发病率高、复发率高、致残率高的“三高”特点[1]。WHO数据显示，目前全球抑郁症患者已达3.22亿人，年至年间患者数量增加了18.4%[2]。且大量研究已证明，抑郁的发生与大脑或者外周5-羟色胺（5-HT）代谢途径紊乱有关[3-4]。复方柴归方是本课题组经过系统溶剂提取，药效筛选和化学成分指纹图谱分析等方法，并通过药效成分归属和原方汤剂临床观察对逍遥散进行化裁得到的新处方，由柴胡、当归、白芍、炒白术、炙甘草、薄荷6味中药组成[5-11]。前期应用小鼠悬尾、强迫游泳等实验初步证明了复方柴归方的抗抑郁作用[12-14]，但其确切的抗抑郁效果及作用机制尚需进一步深入研究。
本研究采用慢性温和不可预知应激（CUMS）抑郁模型，通过行为学指标验证复方柴归方抗抑郁的药效，并应用超高效液相色谱-三重四极杆质谱方法（UHPLC-MS/MS）测定大鼠血清中色氨酸（Trp）、5-HT、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）的量，探讨抑郁模型大鼠5-HT代谢途径的改变及复方柴归方干预后的作用机制。为复方柴归方的抗抑郁药效及其调控5-HT代谢途径的作用机制研究提供依据，也为后期将其开发成抗抑郁新药奠定基础。
1材料1.1动物
雄性SD大鼠，SPF级，体质量～g，购买于中国食品药品检定研究院，动物许可证号为SCXK（京）-，饲养于中国辐射防护研究院药物安全评价中心动物饲养室。
1.2药品与试剂
复方柴归方由柴胡、当归、白芍、炒白术、炙甘草、薄荷6味药材提取而成（组方药材质量比为6∶6∶6∶6∶3∶2），由湖南九芝堂股份有限公司加工制备（批号0701，提取物中含芍药苷4.5mg/g）；盐酸文拉法辛胶囊（25mg/粒，批号，成都康弘药业集团股份有限公司）；舒肝解郁胶囊（0.36g/粒，批号，成都康弘药业集团股份有限公司）。
对照品Trp（批号KV）、5-HT（批号BCBRV）、5-HIAA（批号BCBMV）均购于Sigma公司，各对照品质量分数均在98%以上；内标3,4-二羟基苯甲酸（DHBA，批号MKBSV）购于Sigma公司；甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，水为超纯水。
1.3仪器
II超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；3QTRAP三重四极杆串联质谱仪（美国ABSciex公司）；Neofuge13R高速冷冻离心机（中国力康公司）；MX-S可调式混匀仪（美国Scilogex公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；大鼠旷场实验行为测试箱（自制，长cm、宽cm、高70cm的无顶部长方体，内部四壁及底面涂成黑色，底部用白线划出25个边长为20cm的正方形小格）。
2方法2.1CUMS模型复制、分组与给药
大鼠适应性饲养7d后根据糖水偏爱实验基线、旷场实验和体质量基线测定的数据随机分为7组，每组12只，即对照组，模型组，化学药阳性对照组（盐酸文拉法辛胶囊35mg/kg），中药阳性对照组（舒肝解郁胶囊mg/kg），复方柴归方高、中、低剂量（16.6、8.3、4.2g/kg）组，除对照组外，其余各组单笼孤养，同时依据Willner等[15-16]的造模程序并结合本实验室前期基础进行造模，刺激程序包括：禁水24h、热刺激10min、冰水游泳5min、超声刺激3h、夹尾2min、昼夜不分12h、足底电击10次、束缚3h、禁食24h。造模同时ig给药，对照组和模型组ig给予蒸馏水10mL/kg，各给药组ig给予相应剂量药物，给药1h后给予上述刺激，每天1种，为保证刺激程序的随机不可预知性，每种刺激不连续出现，出现总次数不超过4次，实验持续28d。在实验第0、28天分别测定各组大鼠体质量、糖水偏爱率和大鼠旷场实验中的穿越格数、直立次数、中央格停留时间、进入中央九宫格次数。
2.2行为学观察
2.2.1糖水偏爱率实验实验前孤养每只大鼠并给予1瓶自来水，1瓶现配的1%蔗糖水进行糖水甜度偏好的训练，自来水瓶和蔗糖水瓶位置固定，12h糖水训练后撤掉水瓶禁水23h，进行1h的糖水偏爱率测定。
糖水偏爱率=蔗糖水消耗量/总饮水消耗量
2.2.2旷场实验实验期间将大鼠平托放于旷场实验行为测试箱中央格，开始计时5min，记录大鼠的中央格停留时间：从放入大鼠置中央格到逃离中央格所需时间（s），穿越格数：后4min中大鼠跨越格子的数量，直立次数：后4min中大鼠两爪抬起远离地面的次数，穿越中央九宫格次数：后4min中大鼠进入中央九宫格区域的次数。
2.3大鼠血清Trp、5-HT、5-HIAA水平的测定
2.3.1血清样本收集在实验结束后，股动脉方式采集大鼠血液，置于EP管中，静置30min，在4℃，r/min离心15min，分离血清并分装，置于?80℃冰箱保存。
2.3.2对照品溶液和内标溶液的配制分别取Trp对照品约50mg，5-HT、5-HIAA对照品约10.0mg，精密称定，置10mL量瓶，加入溶剂（0.2%甲酸水溶液-甲醇8∶2）溶解，制成质量浓度分别为5.、1.、1.mg/mL的对照品溶液，作为母液。
分别精密吸取适量对照品母液，置于同一量瓶中，混匀，加入溶剂（0.2%甲酸水溶液-甲醇8∶2）至刻度，混匀，制得质量浓度分别为.0、.6、.5、.4、86.7、43.35、8.67μg/mL的Trp，15.3、12.24、7.65、3.06、1.53、0.、0.μg/mL的5-HT，2.55、2.04、1.、0.51、0.、0.1、0.0μg/mL的5-HIAA混合对照品系列溶液。置4℃冰箱保存，备用。
称取DHBA对照品约5mg，精密称定，置5mL量瓶中，加入溶剂（0.2%甲酸水溶液-甲醇8∶2）溶解，制成质量浓度约为1mg/mL内标母液。精密吸取适量内标母液，置mL量瓶中，加溶剂（0.2%甲酸水溶液-甲醇8∶2）至刻度，制成质量浓度为3.6μg/mL的DHBA内标溶液。置4℃冰箱保存，备用。
2.3.3供试样本制备血清样本解冻后摇匀，取μL置于1.5mLEP管中，加入20μL内标溶液和20μL溶剂（0.2%甲酸水溶液-甲醇8∶2），涡旋，加入μL0.1%甲酸乙腈溶液，涡旋，在4℃、r/min离心10min，取上清进行检测分析。
2.3.4色谱与质谱测定条件
（1）色谱条件：WatersAcquityuplchsst3色谱柱（mm×2.1mm，1.8μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度条件：0～2.5min，95%A；2.5～4min，95%～80%A；4～7min，80%～40%A；7～7.5min，40%～95%A；7.5～10min，95%A；体积流量0.2mL/min；柱温30℃；进样量3μL。
（2）质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子模式；多反应监测模式（MRM）；气帘气.8kPa（40.0psi）；碰撞气体N2；喷雾电压V；离子源温度℃；GS.75kPa（50psi），GS.75kPa（50psi）；气体体积流量12L/min。扫描范围：Trpm/z.1→.1、5-HTm/z.1→.1、5-HIAAm/z.1→.1、内标DHBAm/z.2→.1。
2.4统计学处理
采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，实验数据以表示。
3结果3.1对CUMS模型大鼠体质量的影响
由表1可知，与对照组比较，CUMS造模28d后，模型组大鼠体质量显著下降（P＜0.01），表明CUMS刺激程序的应用可能引起大鼠胃肠功能失调，食欲下降，导致个体生长迟缓。与模型组比较，文拉法辛组和复方柴归方各给药组逆转造模引起大鼠体质量下降的能力相当（P＜0.01），且优于舒肝解郁组（P＜0.05）。综上，各给药组增加CUMS模型大鼠体质量作用明显，表明经抗抑郁药物干预后，抑郁样大鼠的生长迟缓有一定的改善作用。
3.2对CUMS模型大鼠糖水偏爱率的影响
糖水偏爱率是衡量动物抑郁模型是否成功的一个重要标志，其模拟抑郁症的核心症状（快感缺失）。由表2可知，与对照组比较，模型组大鼠糖水偏爱率显著下降（P＜0.01），表明CUMS造模程序可能对动物的奖赏反应具有抑制作用，引起快感缺失，造成抑郁样行为的产生。与模型组比较，各给药组均能提高CUMS大鼠糖水偏爱率（P＜0.01），其中，文拉法辛组和复方柴归方高、中剂量组可明显提高CUMS模型大鼠糖水偏爱率，且与对照组比较无统计学差异。
3.3对CUMS模型大鼠旷场行为的影响
由图1可知，在造模4周后，与对照组比较，模型组大鼠穿越格数、直立次数、穿越中央九宫格次数明显减少（P＜0.01），中央格停留时间显著增加（P＜0.01），表明CUMS刺激引起大鼠运动能力和探索能力下降，并伴随对新环境适应性降低的情况。与模型组比较，各给药组改善模型大鼠穿越格数的作用非常显著（P＜0.01），提示给予抗抑郁药物干预后，抑郁样大鼠的运动能力有所回调；在增加直立次数方面，文拉法辛组，舒肝解郁组，复方柴归方高、中剂量组作用非常显著（P＜0.01），低剂量组作用显著（P＜0.05），表明各给药组均可逆转造模引起大鼠探索能力的下降；在减少中央格停留时间方面，复方柴归方高剂量组和文拉法辛组可以显著减少中央格停留时间，改善大鼠探索能力的下降（P＜0.05），其余各给药组具此作用但无统计学差异；在增加穿越中央九宫格方面，文拉法辛组和复方柴归方中剂量组作用显著（P＜0.05），复方柴归方高、低剂量组和舒肝解郁组也可增加穿越中央九宫格次数，但无统计学差异。综上，在给予CUMS模型大鼠复方柴归方后，其行为活动能力均有不同程度的改善。
3.4对CUMS模型大鼠血清Trp、5-HT、5-HIAA水平的影响
如表3所示，与对照组比较，经过28d造模后，模型组大鼠血清5-HT代谢途径上Trp、5-HT水平明显降低，5-HIAA水平明显升高（P＜0.05）。Trp作为5-HT的合成前体，其量不足可导致突触间隙5-HT水平下降，5-HIAA作为5-HT的代谢物，其量增加表明5-HT降解增多，进一步引发突触间隙5-HT水平下降，说明模型的结构有效性较好。与模型组比较，各给药组均能不同程度提高Trp的量，舒肝解郁组和复方柴归方各给药组相当（P＜0.01），且优于文拉法辛组（P＜0.05）；对于5-HT和5-HIAA的调控，各给药组均可调控其水平趋近对照组，但无统计学差异，复方柴归方中剂量组（P＜0.05）、低剂量组（P＜0.01）升高5-HT效果较好，高、中剂量组降低5-HIAA效果明显，且都优于文拉法辛组和舒肝解郁组。此外，由图2可知，模型组5-HT/5-HIAA的值低于对照组和复方柴归方中、低剂量组，具有显著性差异（P＜0.05）。综上，通过药物干预后，各给药组可以不同程度升高模型大鼠血清5-HT代谢途径上Trp水平和降低5-HIAA的量来增加5-HT的量。其中复方柴归方各给药组与舒肝解郁组相当，优于文拉法辛组，表明复方柴归方可能是通过调控异常的5-HT代谢途径增加血清5-HT的量来达到抗抑郁作用的。
4讨论目前，临床上对于抑郁症患者的治疗主要以药物为主，但是已上市的抗抑郁化学药效果并不理想，且多存在起效慢、有效率低、副作用明显等缺陷[17-19]。近年来，随着中医药的不断发展，其在治疗抑郁症时所表现出多成分、多靶点协同增强，毒副作用小的优势逐渐被研究者重视。国内治疗抑郁症的中药复方包括舒肝解郁胶囊、金香疏肝片、舒眠胶囊、安乐胶囊、舒郁胶囊、太子神悦胶囊、奥生乐赛特胶囊等，它们在临床上使用广泛，副作用小，展现出良好的应用前景[20-21]。复方柴归方是本实验室前期从抗抑郁经典名方逍遥散化裁茯苓、生姜形成的中药新复方，与逍遥散相比，在抗抑郁方面有着相似的作用，为其在今后研发成新一代有效的抗抑郁制剂提供了药物有效性方面的保障；在处方组成上，保留了柴胡、当归、白芍、炒白术、炙甘草、薄荷6味中药。方中柴胡疏肝解郁，以使肝气条达，为君药。白芍滋阴柔肝，当归养血活血，二味相合，养肝体以助肝用，兼制柴胡疏泄太过，为臣药。炒白术、甘草健脾益气，使营血生化有源。薄荷少许，助柴胡疏肝而散郁热，为佐药。甘草调和药性，兼为使药之用。综上，逍遥散经过化裁得到的本处方，虽然药味组成简单，但依然遵守中医遣药组方原则，兼顾了方剂君臣佐使配伍的基本规律。
研究表明，CUMS抑郁大鼠模型中，大鼠所表现出来的抑郁状态：行为活动减少，兴趣缺乏以及快感缺失等，被认为与临床诊断为抑郁症的患者所表现出来的精神运动改变、兴趣或快感的丧失密切相关[22-23]。基于此，本研究采用CUMS大鼠抑郁模型，持续慢性应激28d后，与对照组相比，模型组大鼠体质量，糖水偏爱率，穿越格数、直立次数和穿越中央九宫格次数明显减少，中央格停留时间显著延长，表明模型复制成功。在给予复方柴归方后，这些行为学指标的异常状态均有不同程度的回调，提示复方柴归方具有一定的抗抑郁作用。在明确其抗抑郁药效后，基于抑郁症单胺类神经递质缺乏假说，进一步测定CUMS模型大鼠血清中Trp、5-HT、5-HIAA水平，以往研究报道这3种神经递质与抑郁症密切相关[24]，Trp在色氨酸羟化酶的作用下生成5-羟色胺酸，再经芳香族氨基酸脱羧酶的作用脱去羧基生成5-HT，在单胺氧化酶作用下生成5-HIAA。结果表明，复方柴归方各给药组能够不同程度增加血清中Trp和5-HT的量，降低5-HIAA的量，提示复方柴归方可能通过调控5-HT代谢途径达到抗抑郁作用。
经过CUMS造模后，模型组大鼠5-HIAA的量会降低，对照组5-HIAA的量会升高，而本实验对照组5-HIAA的量却降低，CUMS模型组5-HIAA的量升高，对于此种现象，笔者认为：正常状态下的大鼠单胺氧化酶有着稳定代谢5-HT的作用，CUMS造模促进了单胺氧化酶代谢5-HT的能力，从而造成5-HIAA的量增加，图2中5-HT/5-HIAA值从侧面反映了此种现象，这也与近期报道一致[25-26]。但是，复方柴归方各给药组5-HIAA的量与对照组非常接近，提示其可能具有抑制单胺氧化酶活性达到抗抑郁药效的作用机制。此外，复方柴归方各给药组5-HT的量高于文拉法辛组可能是由于中药多成分单靶点叠加、多成分多靶点协同[27]促进5-HT的升高达到抗抑郁作用。文献报道[28-29]，复方柴归方中的阿魏酸、芍药苷影响5-HT能神经系统，苯酞类化合物、多炔类化合物抑制5-HT重摄取，异甘草素抑制单胺氧化酶活性。因此，作为一个中药复方，其中所含活性成分多不胜数，以上这些成分可能从不同靶点协同提高5-HT的量，进而达到最终的单靶点叠加即5-HT量的升高起到抗抑郁作用，当然这还需要更多的实验来研究证实，如从动态研究5-HT代谢途径的变化，并从蛋白、基因层面做进一步的探索。
本研究采用了中药阳性对照组（舒肝解郁）、化学药阳性对照组（文拉法辛）双重阳性药进行对比，弥补了药效研究中的不足，主要体现在以下2点：第一，化学药阳性对照组文拉法辛是市场上较为公认的抗抑郁药物，可以验证抑郁模型复制的成功与否，并能作为药效参照证明复方柴归方的有效性（药物的基本特性）。除此之外，因其作用机制明确，可进一步探究复方柴归方的抗抑郁作用机制。第二，中药阳性对照组舒肝解郁胶囊作为一个中药复方，相比于副作用较为明显的抗抑郁化学药，其在安全性方面存在优势，可考察复方柴归方不良反应、耐受性等问题。而且，它是国内上市的第一个用于临床治疗轻中度抑郁症的中药复方，与复方柴归方的适应症接近，在一定程度上为将复方柴归方研发成新药提供了市场定位和临床前参考。
综上所述，本实验成功复制了CUMS抑郁大鼠模型，通过观察大鼠体质量、糖水偏爱率和旷场实验各行为学的变化，验证了复方柴归方的抗抑郁作用，并进一步检测大鼠5-HT代谢途径上Trp、5-HT、5-HIAA神经递质的变化，揭示了复方柴归方的抗抑郁作用机制可能与调控5-HT代谢途径有关。
参考文献（略）
来源：张涛，赵芳，张潇，高晓霞，周玉枝，田俊生，秦雪梅，复方柴归方抗抑郁作用及其调控5-羟色胺代谢途径机制研究[J].中草药,,49(6):-.
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